小麥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒實驗方法步驟:

方法

1:在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix (2mM)             

4 μl     引物1(10pM)                 

2 μl     引物2(10pM)                 

2 μl     Taq酶 (2U/μl)               

1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)  

1 μl      加ddH2O至 50 μl  

視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

2調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保溫7min。

3結束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl氯仿進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。

PCR實驗步驟

典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應組成一個循環(huán),通過多次循環(huán)反應,使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是:

將待擴增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;

人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合,兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短;

耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入,以目的基因為模板從5’→3’方向延伸,合成DNA的

CSC, 小鼠心肌細胞

小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）

MEF, 小鼠胚胎成纖維細胞

MM, 小鼠小膠質(zhì)細胞

mCF, 小鼠心臟成纖維細胞

MN-c, 小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元

 細胞名稱

人絨毛膜毛細血管內(nèi)皮細胞

人羊膜上皮細胞

人絨毛間充質(zhì)成纖維細胞

人羊膜間充質(zhì)基質(zhì)細胞

人絨毛膜間充質(zhì)基質(zhì)細胞

 正常細胞

NRK-52E，大鼠腎細胞

H9c2大鼠心肌細胞（ATCC來源）

C2C12, 小鼠肌原細胞

NIH/3T3, 小鼠成纖維細胞系

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）

HSC-T6, 大鼠肝星狀細胞系

CHO, 中國倉鼠卵巢細胞系

COS-7L, 非洲綠猴腎成纖維細胞

SF9, 昆蟲卵巢細胞

BRL 3A, 大鼠肝正常細胞

HK-2, 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞

HET-1A, 人食管上皮細胞

RGC-5, 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

GC-1, 鼠精原細胞

293A，人胚腎上皮細胞系（腺病毒包裝級別）

hDPSCs, 人前磨牙牙髓干細胞

293T, SV40轉化的人胚腎上皮細胞系